纳米技术具有广阔的应用前景，特别是在药物递送方面。纳米颗粒的独特性质可以显著提高药物的递送、药效和毒性。对于癌症治疗来说，控制化疗药物的递送可以增加所需部位的药物浓度，提高药物疗效，限制药物毒性。由于脂质体能够携带疏水分子，降低毒性并延长半衰期，所以本研究使用脂质体包封紫杉醇。在多种脂质体制备方法中，选择微流控技术制备脂质体。微流控技术通过调整工艺参数控制脂质体粒径、粒度分布和物理化学性质，这使它优于其他常规方法。本项目旨在制备直径小于200nm的紫杉醇脂质体，其PDI低，均一性高，稳定性好。考察了不同脂质类型(DMPC、DPPC、DSPC、DOPC)不同比例下对空白脂质体处方的影响。通过改变总流量比、流速比等不同微流控参数，研究其对脂质体理化性质的影响。测定最终处方的不同的理化性质(DLS，FTIR)，并进行稳定性研究。测定DMPC和DPPC在总流速为1ml·min−1和流速比为1∶4条件下紫杉醇的包封率和体外释药效果，并对紫杉醇脂质体进行表征和稳定性研究。DPPC和DMPC均有良好的包封率，并观察到药物的持续释放。
1. 前言
根据WHO数据，癌症是世界范围内致死的主要原因之一。癌细胞的侵袭性、增殖性和不可控的生长以及向其他组织和器官的转移是癌症治疗的主要挑战，也是导致死亡的主要原因。多年来，癌症一直是医学领域具有挑战性的难题之一。为了杀死肿瘤细胞并阻止肿瘤转移，目前已采用多种治疗策略，包括放疗、手术、基因治疗、天然抗氧化剂和化疗。
化疗是一种用于杀死癌症的治疗方法，使用的主要是细胞毒性的药物。化疗包括烷基化剂、生物碱、抗生素和抗代谢物，它们通过破坏细胞DNA、RNA及其代谢来靶向细胞周期。化疗药物的选择性差是化疗的重要局限性之一。化疗药物非选择性的细胞毒作用可能影响所有细胞，包括健康细胞和癌细胞。会破坏健康细胞，影响药物安全性，并产生严重的副作用。此外，化疗的非选择性和随机分布，可能会使药物浓度降低到所需组织的治疗浓度以下，影响药物疗效。
靶向化疗给药可以作用于特定组织或器官，是最近用来克服常规给药毒性问题的最有前景的技术。几项研究考察了化疗药物靶向攻击特定癌细胞的疗效。可控的药物递送系统(DDSs)通过不同的靶向途径，如被动靶向、主动靶向和逆靶向，将活性药物成分(APIs)携带和运输到确切的靶组织。因此，药物只在特定的靶组织发挥作用，最小化不良反应。DDSs还可以防止药物加速降解或清除，这增加了药物在靶组织中的浓度。因此使用的药物剂量更低，制造成本也会减少。DDSs要基于各种包封、携带和运输API的载体，包括纳米颗粒(NPs)、水凝胶、泡沫和树状大分子。
在不同的载体平台中，NPs是药物传递领域显著发展的代表。NPs可以根据其形态和化学性质分为碳基、陶瓷、金属、半导体、脂基和聚合物NPs。使用NPs包封药物分子增强了药物的特异性、有效性和安全性。药物传递领域应用NPs给药的主要目的是提高药物靶向和给药的特异性，增强安全性和生物相容性，并在保留治疗效果的同时降低毒性。NPs优异的物理性能是使用它们作为载体的主要原因，例如它们能够吸附并作为其他化合物的载体，它们具有较高的比表面积，以及它们的量子特性。NPs大的“功能性”表面允许它们吸附、结合和携带化合物，如蛋白质、药物或其他功能分子。从生物学上讲，NPs具有特殊的特性，例如跨组织和细胞膜的能力。与其他较大分子相比，NPs被细胞和网状内皮系统(RES)吸收的几率更高。这是由于NPs大的表面积和蛋白冠的存在，其中主要含有调理蛋白，这是增强RES对NP摄取的主要成分。通常，NPs靶向给药的临床成功受多个参数的影响，包括载体的物理和化学性质、药物包封效率、DDS途径、药物释放以及药物载体的毒性。
在本研究中，由于脂质NPs(LNPs)的适当特性，我们选择脂质体包封化疗药物。由于NPs具有良好的生物降解性和生物相容性，被认为是毒性较小的载体之一。LNPs具有包封亲水和亲脂药物并控制药物释放的能力，可以延长作用时间以延长半衰期，也可以作为pH敏感剂来增强药物在特定介质中的释放。此外，LNPs可以被聚乙二醇(PEG)功能化以绕过免疫系统攻击或与抗体相结合以积极靶向特定的肿瘤细胞受体。
脂质体作为药物传递载体的有效性在于其生物相容性、生物降解性、非免疫原性和细胞膜模拟结构。合适的脂质体配方取决于不同的参数，如脂质组成、膜的刚性、表面电荷、制造方法和脂质体的大小。在本研究中，脂质体颗粒尺寸最好小于200nm，以避免对纳米颗粒的任何淋巴清除或免疫反应，并能够穿过肿瘤细胞。低多分散指数(PDI)值和良好的稳定性也是脂质体配方所具有的基本特性，这将进一步讨论。
在药物递送时使用脂质体制剂的主要局限性是粒径大，PDI高，包封效率低，稳定性低。生产方法是影响制备脂质体尺寸、PDI和形态最终质量的主要参数之一。脂质体的不同制备方法可分为传统方法和新方法。传统的方法如薄膜水化、挤出和溶剂注入法被认为是在实验室规模中使用的简单和直接的方法。另一方面，传统的方法有一些局限性，如粒度不可控、粒度分布宽、批次与批次之间的可变性、稳定性问题、难以扩大规模和耗时。微流控(MFs)等新方法是克服传统方法局限性的独特技术。MFs是一种应用在不同药物领域的通用技术，如芯片实验室，器官芯片和NPs制备。MF系统的独特性质之一是系统内的流体流动类型，称为层流。层流是一种有序的平行流动，没有任何流体层的破坏，在整个过程中提供恒定的连续混合。这种类型的流动提供了高混合质量，不同时间点的生产质量相同，减少不同批次的变化，并提高了微型设备的性能。不同类型的微流控技术可用于制备脂质体，如液滴（droplets）、微流体动力聚焦(MHF)、脉冲射流（pulsed jet flow）和西米尔微流控（similmicrofluidic）。MHF和西米尔微流控方法在通过一步生产法制备适当大小和均匀的脂质体方面具有前景。例如，使用西米尔微流控和MHF的一些研究已经成功地制备了脂质体，并通过可持续和连续的过程包载不同的分子。最近，研究人员试图利用薄膜水化法将紫杉醇(PXT)等抗癌药物封装在脂质体内。所得到的配方存在包封率低(<50%)和稳定性问题，如，保存时间有限，循环半衰期过短和药物从载体中泄漏。
本研究利用MHF技术制备包封PXT的脂质体，考察MFs在克服其他方法局限性方面的作用。研究了不同的MF参数，并使用各种方法对配方进行了表征，包括原子力显微镜(AFM)，动态光散射(DLS)，ζ电位，傅里叶变换红外光谱(FTIR)和体外释放。
2. 材料和方法
2.1 材料 DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、胆固醇、PBS（pH7.4）、Tween80、乙醇≥99.8%、乙腈≥99.9%和紫杉醇。化学结构式见Fig. 1。
2.2 方法 2.2.1 脂质体制备 使用FLUIGENT MFCS™-EZ (法国巴黎)微流控流量控制装置及软件制备脂质体。不同类型的磷脂(如DMPC、DSPC、DPPC、DOPC)与胆固醇共同使用。为了研究脂质比例变化对脂质体大小的影响，考察了磷脂与胆固醇的质量比分别为2∶1和3∶1。磷脂和胆固醇以1mg/ml的浓度溶解在乙醇中（≥99.8%v/v）。预先准备好的脂质相放在第一个腔室，磷酸盐缓冲盐水(pH值7.4)作为水相插入第二个腔室（Fig. 2）。将脂质和水相注入到通道直径为100μm的Y型MF芯片中。考察了不同流速比（FRR，1∶2，1∶3，1∶4，乙醇∶水）和总流速比（TFR，1-3ml/min）。每个处方重复制备9次以便于统计分析和数据重现。
包封PXT的脂质体制备时将药物溶解在脂质相，药物浓度为0.08mg/ml（药脂比为1∶12），并超声确保药物溶解完全。该浓度是基于文献中先前的报道，PXT con (3-6) mol %具有良好的溶解性，并在数周内保持稳定。计算所用PXT con(0.08mg/ml)的摩尔数得到PXT的摩尔比约为5mol%。然后从先前的研究中选择最合适的FRR和TFR来包封药物。
2.2.2 脂质体表征 2.2.2.1 粒径和ζ-电位 动态光散射(DLS)系统nanbrook Omni粒度仪(Brookhaven Instruments，Holtsville，NY，USA)测定脂质体粒径和多分散性指数(PDI)。将20μl脂质体处方用PBS稀释至2ml。同样的系统也被用于测量ζ电位。每个样品都测量了三次，同样使用的是最初制备的三份样品（一式三份）。
2.2.2.2 傅里叶变换红外光谱（FT-IR） FTIR分析使用衰减全反射(ATR)-FTIR光谱仪(Thermo fisher scientific，Nicolet is 50 FTIR with built in ATR)进行，以确定最合适的粒径处方和最大粒径处方，以研究每个样品存在的化学键。通过将脂质体处方在14,800rpm离心30分钟来制备样品，收集剩余的颗粒用于分析。脂质体混悬液在惰性气体中扫描，波长范围为4000-600cm−1，扫描次数为64次，分辨率为4cm−1，间隔为1cm−1。每个样本都进行了测试3次，所有样品在第0天进行测试，以减少处方降解的发生率。
2.2.2.3 原子力显微镜（AFM） 采用AFM TT-2 AFM (AFM workshop， US)检测脂质体的形态和分布。每个样品20μl最多被PBS水稀释到2ml，然后15μl放置在切割的云母表面(1.5cm×1.5cm；云母片1”×1”×0.006”；Agar Scientific ltd.，Essex，UK)，并让其风干30分钟。样品用1mlPBS彻底清洗，以去除云母表面不稳定的脂质体。同样，将其晾干30分钟后扫描。AFM成像采用Ohm-cm掺杂锑的硅探针，频率范围50~100kHz。AFM成像分辨率为512×512像素，扫描频率为0.6Hz。
2.2.3 稳定性 在之前的研究基础上，采用最合适处方的空白处方进行稳定性研究。每个样品进行三次分析。将样品分成三组，分别放置在不同的温度：4℃、25℃和37℃。前两个温度是作为储存条件考察，37℃作为体温来模拟给药后体内的条件。每周检测粒径、PDI和ζ电位，持续4周。对于包封药物的处方，除25℃下的稳定性外，测试内容相同。每周测试包封药物脂质体的粒径、PDI和ζ电位，持续4周。
2.2.4 包封率EE%和载药量DL% 采用两步离心法制备样品。1ml脂质体混悬液在14，800rpm离心30分钟，取上清液进行后续分析。之后，将1毫升新鲜PBS添加到沉淀物中，进行第二轮离心，以提取物理吸附在脂质体表面的任何药物。采用紫外高效液相色谱法(UVHPLC)对两种上清液进行分析。使用C18色谱柱(250mm×4.6mm)在227nm测定游离药物。所用方法基于文献中PXT脂质体的研究；以乙腈和水为流动相，梯度为50∶50，等度洗脱10min。使用的总流速为1ml/min，样品进样量为50µl。使用下式分别计算EE%和DL%：
2.2.5 药物体外释放 采用透析管法进行药物释放研究，对每个样本进行3次分析。透析袋(纤维素膜，avg.flat width 10mm，0.4英寸，MWCO 14000，Sigma Aldrich)在分析前已经用去离子水煮沸和去离子水冲洗。将脂质体制剂以14,800rpm离心30分钟，去除上清液，用PBS水将脂质体水合并添加到透析袋中。释放介质为含有2%Tween80的PBS水溶液。由于PBS缓冲液的pH为生理pH(7.4)，因此将其用于脂质体释放研究以模拟体内环境。吐温80被用于增强释放介质溶解释放出来的PXT。
2.2.6 统计分析 所有实验均一式三份，并计算平均值和标准差。采用普通-单因素方差分析(ANOVA)确定统计学显著性，包括在TFR为1ml/min时，所有脂质的数据（P<0.08）及DMPC和DPPC不同FRR的数据。对药物释放浓度进行T检验。
3. 结果和讨论
3.1 空白脂质体制备 本研究的目的是制备直径<200nm，PDI≤0.25，稳定性好的脂质体。为了优化脂质体制备方法，考察了微流控中的几种制备参数，如TFR、FRR、不同的磷脂类型和不同的磷脂和胆固醇比例。一般来说，在大多数配方中，TFR从1变到3ml·min−1(除TFR为3ml·min−1外)对脂质体直径的影响很小（Figs. 3–5）；FRR相同时，增加或减少TFR可以得到类似的脂质体直径，这与之前的研究相似。另外，TFR影响脂质体处方的PDI。TFR增加，PDI值增加，这与之前的研究相似。增加TFR会影响脂质体处方的稳定性；TFR增加到2ml·min−1，稳定性变差。FRR与脂质体直径成反比关系；将FRR从1∶2增加到1∶4，脂质体聚集减少，制备脂质体直径变小，这与先前报道的研究趋势相似。FRR与PDI值的变化呈反比；增加FRR使某些样品的PDI值变小。FRR的增加有助于脂质体处方的稳定；1∶4处方比1∶2处方更稳定。
采用多种脂质制备脂质体；使用DMPC、DPPC、DSPC、DOPC研究不同碳链长度对脂质体直径及稳定性的影响。DSPC和DOPC具有相同的烃链长度，但烃链饱和度不同；双键(C=C)存在于DOPC链中。此外，脂质(DMPC Tm 23℃，DPPC Tm 42℃，DSPC Tm 55℃，DOPC Tm−17℃)的转变温度的变化是另一个特性，研究其对处方稳定性的影响。提高磷脂酰基长度和转变温度(DSPC＞DPPC＞DMPC)，脂质体直径增大。
PDI平均值与脂质体大小(DSPC＞DPPC＞DMPC)变化趋势相同；不同脂质处方PDI平均值均为DMPC(0.22)，DPPC(0.23)，DOPC(0.27)，DSPC(0.40)。脂质类型也影响处方的稳定性；DPPC和DMPC处方比DSPC和DOPC处方更稳定。磷脂与胆固醇联用可以提高脂质体的稳定性，改变脂质体的刚性；胆固醇是一种刚性类固醇，具有调节脂质链排列和减少囊泡结构不稳定性的能力。两种磷脂与胆固醇的比例(2∶1和3∶1)可以为脂质体提供了期望的直径和稳定性；磷脂与胆固醇比例为2∶1时，脂质体尺寸更小，更均匀，PDI更低。采用相同的制备参数，分别用DMPC，DPPC，DSPC和DOPC制备脂质体并用DLS进行表征，以筛选脂质。
乙醇被用作极性溶剂，它可扩散到水相并触发脂质体的自组装。先前的研究表明，由于乙醇的收缩效应（shrinkage effect），乙醇对降低脂质体直径有显著影响。此外，其他研究表明，乙醇能够改变体系的净电荷，并为其提供一定的空间稳定性，从而导致平均颗粒直径的减小。
3.2 空白脂质体的表征 3.2.1 粒径和Zeta电位 采用四种不同磷脂制备得到的脂质体具有不同大小、多分散性和zeta电位。用于脂质体制备的四种不同磷脂提供了的脂质体。不同脂质在不同TFR和FRR下所制备的空白脂质体直径如Figs. 3–5所示。
3.2.1.1 DSPC (Fig.3) 最适宜的处方是TFR为1ml·min−1，DSPC与胆固醇的比例为2∶1和3∶1时制备。在不同TFR的两种配比下，脂质体的大小与FRR的增加呈负相关；将FRR从1∶2增加到1∶4可以制备更小的脂质体，这与之前文献中的趋势相似。在TFR为1、2和3ml·min−1时，脂质体直径随着FRR的增加而下降，这是由于最终溶剂浓度的降低；据报道，最终溶剂浓度的降低会抑制粒子融合，从而降低奥斯特瓦尔德熟化现象的发生率。在TFR为1ml·min−1，FRR为1∶4，磷脂与胆固醇的比例为2∶1时，制备得到的脂质体直径最小，为165±1nm。在相同的FRR下，增加TFR并不影响脂质体直径，如在TFR为1和2，FRR为1∶3和1∶4，脂质和胆固醇比例为2∶1和3∶1的结果。这也与文献中之前研究的结果相似。在TFR为3，FRR为1∶2和1∶3时，脂质体大小与FRR呈负相关。SD高、PDI(0.5)高，DLS检测到聚集物。有些样本无法用DLS测试；这可能是由于高脂质体融合率(奥斯特瓦尔德熟化)，需要进一步的研究来解释，如原子力显微镜(AFM)或红外光谱。总体而言，DSPC脂质体制剂具有变动大、均匀性不好，PDI值高。
3.2.1.1 DMPC (Fig.4) DMPC与胆固醇比例为2∶1的脂质体比为3∶1的脂质体更合适。2∶1处方具有较低的SD（min，0.16）和PDI值（max，0.28），表明均一性好。对于3∶1配比的处方，PDI值较高(0.233~0.346)，表明部分处方的均匀性较低。当DMPC与胆固醇的比例为2∶1时，与其他TFR相比，TFR为1ml·min−1的产生的粒径范围更小；FRR为1∶4，TFR为1ml·min−1时粒径最小（147±19nm）。
3.2.1.3 DPPC（Fig 5） DPPC与胆固醇比例为3∶1比2∶1的稳定性差，粒径、PDI和SD也更大。DPPC和胆固醇比例为2∶1，TFR为1ml·min−1，FRR为1∶4时得到的粒径最小，为168±4nm。
3.2.1.3 DOPC（Fig 6） DOPC制备出大小非常合适的脂质体；大多数的处方得到的脂质体粒径在200nm范围内，其中5个是＜200nm。磷脂和胆固醇比例为2∶1和3∶1的PDI平均值为0.25，这是脂基DDS可以接受的数值。磷脂与胆固醇比例为3∶1时具有较小的平均粒径，比2∶1的比例有较高的SD和PDI值。磷脂与胆固醇的比例为2∶1的处方粒径相似，TFR为1ml·min−1制备的平均粒径最小。TFR为1ml·min−1，FRR为1∶4，DOPC和胆固醇比例为2∶1时粒径最小，为193±45nm。FRR最小时脂质体粒径最大；不同TFR下，FRR增加脂质体粒径减小。
脂质体PDI大小和脂质体粒径同样重要；它们都会影响稳定性、处方性质、产品性能和最终产品的外观。脂质体直径和PDI是促进细胞内吞摄取的主要理化特性。此外，FDA最新关于脂质体药物处方的《行业指南》强调了粒径和粒径分布的重要性，均为“关键质量属性(CQAs)”(美国，2018)。因此，确定PDI的可接受范围是脂质体制剂质量控制的基础。对于脂基载体，PDI＜0.25的处方表明脂质体是均匀的，并被认为可以满足药物传递的目的。
zeta电位是影响脂质体处方稳定性和脂质体进入细胞膜的重要因素。研究中所有脂质体处方都被认为是中性或带轻微负电荷。中性脂质体被RES细胞识别和破坏的倾向较低，并阻碍脂质体的早期消除，与阴离子或阳离子脂质体相比，这增加了血流中的滞留时间。
本研究的主要目的之一是确定最佳脂质类型、TFR和FRR来制备脂质体，并将PXT包封在其中。多种脂质都可以制备得到满足药物递送的脂质体：直径＜200nm，PDI和SD低。每种脂质最合适的脂质体处方见Table 1。优选出的脂质体制备参数是TFR为1ml·min−1，FRR为1∶4，脂质为DMPC和DPPC。因此之后的稳定性研究采用以上处方和制备参数。
3.3 装载紫杉醇的脂质体制备 PXT被认为是应用最广泛的抗肿瘤药物之一，用于治疗广泛的癌症，如子宫内膜癌、乳腺癌、宫颈癌和膀胱癌。之前的研究报道了PXT存在水溶性低、释放量不足、治疗指数低、患者耐药等局限性。将PXT包裹在脂质纳米颗粒中可能会克服这些限制。DMPC和DPPC被确定用于包载PXT脂质体制备，TFR为1ml·min−1和FRR为1∶4。包载PXT后脂质体直径变化；在DMPC样品中，脂质体直径增大，而在DPPC样品中，脂质体直径减小。对于含有PXT的脂质体，PXT具有拓宽DPPC膜相变的能力，这为药物掺入DPPC双分子层提供了证据。此外，其他数据表明，PXT拓宽DPPC相变的能力高于DMPC。与以前使用常规方法进行包封的研究相比，颗粒尺寸的增加是可以理解的。包载后，与空白脂质体相比，监测PDI变化很重要。包载后的PDI结果很好。
部分样品的PDI值略有增加，其余样品保持不变。这种新型的微流控体系是PDI取得良好结果的主要原因。在之前的研究中，使用不同的方法封装PXT，如薄膜水化法，封装后PDI值增长到两倍。封装后，测定zeta电位以监测封装API后静电荷的任何变化。zeta电位给出了关于粒子性质的暗示，特别是处方稳定性，以及给出了关于分子的药理相互作用的指示。包封PXT后，中性或微阴离子脂质体的阴离子性增强。DMPC处方的Zeta电位从−5.5下降到−10，DPPC处方的Zeta电位从−7下降到−11。与对照脂质体相比，zeta电位的降低增强了包封脂质体的稳定性；更多的阴离子电荷会增加脂质体之间的斥力，并防止脂质体聚集。总的来说，PXT脂质体处方的主要目的是将PTX递送至肿瘤位置；脂质体的静电荷可根据肿瘤位置改变。例如，多项研究发现阳离子脂质体对肿瘤血管增生具有较高的靶向效率。另一方面，阴离子脂质体和中性脂质体在血液循环中停留时间较长并被动扩散到组织中。
3.3.1 稳定性研究 稳定性研究的结果表明，与4℃和室温保持相对恒定相比，大多数处方在37℃时颗粒粒径和SD显著增加。稳定性研究以空白脂质体为对照，测定脂质体作为载体的物理稳定性。通过比较两种磷脂(DMPC和DPPC)，结果表明，在37℃，空白DMPC处方比空白DPPC处方更稳定。PDI结果见Fig 7，37℃时，DPPC的PDI值比DMPC明显增加。稳定性研究在不同的TFRs(1和2ml·min−1)和FRR(1∶2，1∶3和1∶4)中进行。改变TFR对DMPC处方稳定性没有影响，而DPPC处方改变TFR后在处方稳定性方面表现出很大的变化。根据已知的知识，DPPC的碳氢链长度比DMPC长，具有较长碳氢链的磷脂双分子层的结构由于范德华力更强，似乎更大的增强对膜内分子的横向填充。DPPC粒径明显增大可能是由于头部区域(被认为密度较高的区域)的比例随着烃链长度的增加而减小。这可以解释为极性头群的方向补偿了烃链横向相互作用造成的高填充。
为研究包封PXT对脂质体物理稳定性的影响，对包载PXT脂质体进行了稳定性研究(Fig 8)。结果表明，DPPC含药脂质体可提高其物理稳定性。DPPC脂质体包载PXT后粒径减小可能与疏水PXT在烃链之间的紧密堆积以及在药物和碳氢链之间的相互作用(如van der Waals)有关。PDI值符合要求且可重复，DMPC的PDI值为0.15，DPPC为0.18。包封PXT后，zeta电位向阴离子方向变化，影响了聚合物的稳定性，降低了团聚的发生率。
3.3.2 FTIR结果 对最合适的处方和大颗粒处方进行FTIR分析，以研究样品内的化学键。使用不同磷脂胆固醇比的DMPC、DPPC和DSPC制成的空白脂质体的特征峰显示相同的官能团，但峰内的吸收不同。磷脂具有相似的吸收峰和化学键，包括醇峰的(O-H)键，范围为[3218-3349cm−1]。观察到(O-H)峰也有可能是因为在制备过程中使用了乙醇。在[2850-2958cm−1]范围内观察到不同形状的烷烃峰(C-H)键，表明烷烃链对称区域的C-H键被拉伸。烯烃峰波数的主要变化是不同碳链长度的磷脂吸收强度的差异。胺峰的(N-H)键通常在[3300-3000cm−1]区域观察到，而这里的胺峰在[1176-1230cm−1]范围内，这表明C-N键存在拉伸振动。在[910-990cm−1]范围内检测到的磷酸盐峰(PO4−)群表明对称拉伸振动。
在碳氢链中测量到了对称C-H拉伸振动区域内的间扭式构象数。PXT的加入导致了在DMPC和DPPC中对称区域的改变(C-H)，将其从2850cm−1略微移至2852cm−1。这表明了间扭式构象的增加和碳氢链排列的改变。对称区域的任何微小变化都是至关重要的，因为它对烃链中的任何流动性或构象变化都很敏感。 Zhao等人也通过红外光谱研究了PXT对DPPC脂质体和包载PXT的DPPC脂质体的分子构象。PXT包封后，C-H拉伸对称区域发生了位移，对称位置的宽度扩大，表明烃链的迁移率提高。
PXT包封后明显的新峰为(C-H)出现在1967cm−1的芳香族化合物的弯曲。芳香化合物的检测证实了PXT的包封。与其他使用的分子相比，包括胆固醇(类固醇)和磷脂(极性脂类)，PXT是一种高芳香性分子。
3.3.3 AFM 结果 AFM图像表征了脂质体包封前后的形态。空白DMPC脂质体的形状相对较圆，分布均匀，而DPPC脂质体的形状为棒状，形状不均匀（Fig 9)。不均匀的DPPC脂质体可能是由于干燥步骤，它影响脂质体的大小和形状。包封后(Fig 10)，DMPC的处方无明显差异。对于DPPC，脂质体的形态特征发生变化，变得更加圆形和规则。这可以解释为PXT和DPPC链之间的填充增强，并产生分子的相互作用，使整体处方更加均匀。DLS的结果也支持这一观点，DPPC包封后的粒径减小了。
3.4 载药量和包封率（EE） 与薄膜水化法和挤出等常规方法相比，微流控法对提高PXT的EE效果显著。几项研究表明，使用常规方法，脂质体内PXT的EE有限；薄膜水化法及挤出制备的脂质体EE% < 50%。然而，乙醇注射方法及其变体(例如：西米尔微流控（similmicrofluidic）)取得了相对较高的EE%，与MF方法相当。使用MHF不仅可以获得合适的粒径和控制良好的PDI，而且可以提高两种配方的EE%，DMPC为88%和DPPC为91%，这也支持了之前报道的结果。所使用的许多参数都提高了PXT的EE%，如脂质类型。正如在之前的其他脂质体处方中所见，使用DMPC和DPPC的EE尤其高。研究表明，具有较短烃链的脂类(DMPC(C14)，DPPC(C16)，DSPC(C18))可以达到更高的EE。此外，将磷脂与特定量的胆固醇(30%-50%)结合对EE有积极影响；这可以解释为胆固醇在脂质体系统中有脂质灵活性与胆固醇稳定性和刚性之间平衡的能力。文献中先前的工作表明，胆固醇部分与脂质体双分子层内增强药物融合之间存在直接关系；这可以解释为胆固醇增加膜的疏水性的能力，这增强了疏水性API的包合。同时，计算了载药量，DPPC为6.8%和DMPC为6.5%。作为纳米体系，由于进料药物浓度较低，载药能力结果与其他研究相当。例如，一些研究尝试用不同的方法将紫杉醇包封在纳米脂质体内，载药量<8%。进一步的研究可以提高载药能力
3.5 体外释放 DMPC和DPPC样品的释放情况具有可比性。DPPC释放百分率比DMPC释放百分率更多(Fig 11)。两种处方在24小时后开始释放，这表明可以延迟药物释放。药物的延迟释放可以用PXT的疏水性质来解释，这使得脂质体双分子层成为药物分子的有利介质，而不是释放介质。由于减少早期的释放，这种延迟释放可以限制对正常组织的附带毒性。24小时后，DPPC释放百分比的开始显著上升，并在60h达到稳态。DMPC的释放百分比较低，且在60h时达到稳态。进行T检验时，两种制剂的释放量静态地差异不显著。释药量的差异可能与包封效率的差异有关。一般来说，将PXT封装在脂质体中，比24小时内释放的游离PXT(Taxol)具有可控释放的优势。
4. 结论
微流控体系在制备均匀和可重复的PXT脂质体方面很有前景。微流控的高质量混合以及控制制造方法参数(如FRR和TFR)的能力可以提高脂质体的特性，可以通过控制纳米粒的大小，降低PDI值，及增强处方均一性和可重复性。
此外，与其他常规方法相比，微流控体系具有提高脂质体包封率的能力，为靶向PXT给药提供了最佳的给药体系。本研究重点研究了磷脂类型和磷脂胆固醇比对脂质体大小、PDI和包封率的影响。与具有较长酰基链的DSPC相比，DMPC和DPPC的短酰基长度是较小的粒径和均匀的处方。胆固醇比例提高脂质体的稳定性，优化的磷脂与胆固醇比为2∶1。总体而言，在DMPC和DPPC脂质体中，PXT在DPPC处方中装载量较高，并呈现出缓释特征。PXT脂质体配方可以通过几种方式进一步优化，例如用特定的单克隆抗体(mAb)包裹脂质体或将脂质体修饰为pH-敏感脂质体以靶向消化系统中的特定位置。
注释：学海无涯，个人学识有限，如果有错误之处，欢迎各位批评指正。
参考资料： 1. Microfluidic paclitaxel-loaded lipid nanoparticle formulations for chemotherapy https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2022.122320
